分子生物學常用實驗方法介紹

總RNA的提�。═rizol法提�。�

在收集到生物材料之后，最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。

1. 提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解；提取細胞RNA時，先離心沉淀細胞，每5-10 ╳10⁶個細胞加1ml Trizol后，反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞；
2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；
3. 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘；
4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘；
5. 棄上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；
6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。                       

PCR

實驗室常用DNA聚合酶有三種：TaKaRa Taq^TM，TaKaRa E_XTaq^TM和Pyrobest^TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq^TM是一般的DNA聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達的檢測等。TaKaRa E_XTaq^TM是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴增得到的PCR產物3’端附有一個“A”堿基，如果希望直接將產物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest^TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐熱性DNA聚合酶，其特點是保真性極高，擴增得到的PCR產物為平滑末端。如果進行基因的擴增請使用此酶。

1. 按下列組成在PCR反應管中調制反應液：

TaKaRa Taq^TM或TaKaRa E_XTaq^TM的配方

Pyrobest^TM DNA Polymerase的配方

• 反應總體積根據實際情況進行調控，可以做20~50µl以節約試劑；
• 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；
• 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發；
• 按以下程序進行PCR擴增。

PCR反應條件視模板、引物等的結構條件不同而各異，在實際操作中需根據具體的情況以及PCR結果而進行優化。

反應結束后，抽取擴增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

RT-PCR

Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)

1. 按下列組成在PCR反應管中調制反應液

1. 反應總體積根據實際情況進行調控，可以做20~50µl以節約試劑；
2. 將上表各成分加入到0.2ml或0.5ml滅菌的PCR薄壁管中；
3. 如果不用PCR儀的加熱蓋，在反應混合液的上層加30 ~50µl 的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發；
4. 按以下條件進行反應

反應結束后，抽取擴增樣品5µl，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，用DNA marker判斷擴增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用。

瓊脂糖核酸電泳

1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；
2. 根據欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內，定量加入電泳緩沖液（一般20~30 ml）；
3. 放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；
4. 室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內；
5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內有氣泡，應設法除去；
6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液（loading buffer），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內；
7. 接通電源，紅色為正極，黑色為負極，切記DNA樣品由負極往正極泳動(靠近加樣孔的一端為負)。一般60～100V電壓，電泳20～40min即可；
8. 根據指示劑泳動的位置，判斷是否終止電泳；
9. 電泳完畢，關上電源，在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。

膠回收純化DNA

1. 瓊脂糖電泳，將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中，稱瓊脂糖帶的重量；
2. 按照每100mg加400µl的量加入binding buffer，放入到EP管振蕩器中，45℃～55℃溫育振蕩，直到所有的瓊脂糖都溶解（大概要5分鐘）；
3. 取出純化柱，將上述溶解液轉移至柱中，室溫下放置2分鐘，8,000rpm 離心1分鐘，棄EP管中的液體，將純化柱放回EP管中；
4. 加500µl的wash buffer至柱中，8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液；
5. 重復操作4步的操作1次，最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒，除去痕量的wash buffer；
6. 將純化柱放入一個新的EP管。加30~40µl H₂O或者elution buffer至純化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分鐘，10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA，將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。
7. 注：若想要不電泳而直接純化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的binding buffer,其余的步驟不變。

大腸桿菌質粒DNA的提�。▔A裂解法）

此方法適用于小量質粒DNA的提取提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。

1. 取1.5ml細菌培養物于EP管中，4000rpm離心1分鐘，棄上清液，使細菌沉淀盡量干燥；
2. 將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 µl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，劇烈振蕩；
3. 加入200 µl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，蓋緊EP管口，快速顛倒離心管5次，以混合混合物，確保離心管的整個內表面與溶液II接觸，不要渦旋，置于冰浴中；
4. 加入150 µl預冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸鉀，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H₂O)，蓋緊EP管口，反復顛倒數次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上3~5分鐘；
5. 在最大轉速下離心5min，取上清液于另一新EP管；
6. 用兩倍體積的乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合于室溫放置2分鐘，最大轉速離心5分鐘；
7. 小心吸去上清液，將離心管倒置于濾紙上，以使所有液體都流出，在將附于管壁的液滴除盡；
8. 加1ml 70％乙醇洗滌沉淀，振蕩混合，用12,000g離心2分鐘，棄上清，將開口的EP管置于室溫使乙醇揮發，直至EP管中內沒有可見的液體存在（5～10分鐘），用適量的ddH₂O溶解；
9. 用0.5µl的RNase 37℃溫育5~10分鐘；
10. 電泳鑒定。

乙醇沉淀DNA

1. 加入1/10體積的乙酸鈉（3 mol∕L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 mol∕L；
2. 加入2倍體積用冰預冷的乙醇混合后再次充分混勻置于-20℃中15~30分鐘；
3. 12,000 g離心10分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4. 加入1/2離心管容量的70％乙醇，12000g離心2分鐘，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
5. 于室溫下將開蓋的EP管的置于實驗桌上以使殘留的液體揮發至干；
6. 加適量的ddH₂O溶解DNA沉淀。

酶  切

1. 酶切前確定待切樣品的濃度, 并選擇合適的限制性內切酶和配套Buffer。
2. 在離心管中加入如下成分：

10×Buffer  1μl

待切樣品  xμl

酶        0.5-1μl 

加水補足10μl

1. 混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底。
2. 將離心管置于37℃中溫育1-3hr，若待切樣品為PCR產物，則可將反應時間適當延長。
3. 用未酶切的質粒作為對照，瓊脂糖電泳鑒定酶切結果。

注：當酶切樣品用于回收而不是鑒定時，可按比例適當加大反應體積。雙酶切可選用二者活性都較高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反應。）

連 接

1. 連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度。
2. 在離心管中加入如下成分：

10×連接Buffer 1μl

待連接的樣品（膠回收產物或PCR產物，載體與片段的mol比為1∶3-5）

連接酶0.5-1μl 

加水補足10μl

1. 混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底。
2. 將離心管置于連接酶要求的溫度孵育適當的時間（根據不同公司的酶的要求而定，一般為22℃ 1-3hr或16℃連接過夜）。

連接完的樣品可直接用于轉化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受態細胞的制備

1. 挑取適當菌株的E.coli單菌落接種于2ml SOB培養液中，37℃搖床過夜。
2. 取0.5-1ml過夜培養的菌液轉種到50ml SOB中，18℃劇烈震蕩，直到A₆₀₀達到0.6。
3. 將培養物轉移到50ml離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。
4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養液被吸干。
5. 取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心10min。
6. 棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養液），冰浴10min。
7. 加入280μl  DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。
8. 將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。
9. 取兩管感受態細胞分別加入1μl無菌ddH₂O（陰性對照）和1μl純質粒（陽性對照）進行轉化（見后），以檢測感受態的質量。陰性對照平板上應該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數目的多少顯示感受態效率的高低。

SOB的配制：

蛋白胨        20g

酵母提取物    5g

NaCl          0.58g

KCl           0.186g

100×Mg⁺⁺溶液10ml

溶解并加水定容至1L，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

100×Mg⁺⁺溶液：  

MgCl₂﹒6H₂O

MgSO₄﹒7H₂O

溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高壓蒸汽滅菌

TB溶液的配制：

   1M  KCl                       5ml

0.55M MnCl₂                    2ml

0.5M  CaCl₂                    0.6ml

0.1M K-Pipes(pH 6.7)             2ml

ddH₂O                         10.4ml

Total                         20ml

注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理

0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

     稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H₂O中，此時粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固體調節PH值，只有當PH接近6.7時粉末才能完全溶解，此時當小心少量地加入KOH直至達到所需PH值。

轉 化

1. 取100μl感受態細胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl純質�；蜻B接產物，輕輕吹打混勻，冰浴30 min。
3. 將菌液放入42℃水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2 min。
4. 加入0.9ml SOC，于37℃恒溫搖床上200rpm×1hr溫育。
5. 將菌液4000rpm/min離心3min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當抗生素的瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養過夜。
   1. 注：新倒的平板可于37℃培養箱中預先放置數小時至過夜干燥。
   2. 當轉化的是TA克隆連接產物時可在菌液中加入8μl1M IPTG和40μl  20mg/ml X-gal以進行藍白斑篩選。

重組子的篩選和鑒定

重組子可通過酶切進行鑒定，也可以利用擴增引物通過PCR進行鑒定，陽性重組子能切出所需要的片段或得到相應片段的PCR產物。

1. 用牙簽挑取平板上的菌落接種于2ml含適當抗生素的LB培養基中，37℃搖床培養過夜。
2. 次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min離心，棄上清，加入20μl  ddH₂O和20μl酚/氯仿，震蕩混勻，13,000rpm×5min離心。
3. 取上清進行瓊脂糖電泳，加入載體質粒DNA作為陰性對照，根據質粒大小初步篩選重組子，重組子的泳動速度應該慢于載體質粒。
4. 用堿法小量制備可能是重組子的質粒DNA。
5. 選取適當的酶，對重組子進行酶切分析，酶切體積均為10μl體系。酶切樣品進行瓊脂糖電泳鑒定是否有所需片段。
6. 酶切分析正確的重組子分成兩份，一份進行測序反應，另外一份保種。
7. 若用PCR法鑒定，則在第2步時每個樣本取0.5-1.0μl 菌液為模板進行PCR反應，每管反應體系最低可少至10μl，PCR產物電泳，能得到所需條帶的樣本進一步提取質粒酶切鑒定或送樣品測序。

真核細胞的轉染

該操作以Invitrogen公司的脂質體轉染試劑LipofectAMINE為例，其它轉染試劑可參照各自的使用說明書進行。

1. 在6孔板中接種1-3×10⁵細胞/孔，加入2ml完全培養基，置CO₂孵箱中37℃培養過夜。
2. 待細胞長到50-80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液：
   1. 溶液A：將1-2μg待轉染的超純DNA稀釋到100μl無血清培養基中
   2. 溶液B：將2-25μl  LipofectAMINE稀釋到100μl無血清培養基中
3. 混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置15-45min。
4. 用2ml無血清培養基輕輕洗滌細胞，加入0.8ml無血清培養基/孔，將脂質體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO₂孵箱中37℃孵育2-24hr。
5. 用完全培養基替換轉染液，繼續培養。
6. 24-72hr后檢測蛋白質的表達或傳代并加入選擇性抗生素以篩選穩定表達株。

轉染細胞的穩定篩選

1．確定抗生素作用的最佳濃度：

不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。

1. 提前24小時在96孔板或24孔板中接種細胞8孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO₂孵箱中37℃培養過夜。
2. 將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3. 培養10-14天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為400-800μg/ml,篩選穩定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.

2．轉染按前面的步驟進行。

3．轉染72小時后按1:10的比例將轉染細胞在6孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6孔板內可見單個細胞，繼續培養可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

1. 濾紙片法：用消毒的5x5mm濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細胞集落上10-15秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24孔板中繼續加壓培養。細胞在24孔板中長滿后轉入25cm²培養瓶中,長滿后再轉入75cm²培養瓶中培養。
2. 有限稀釋法：將細胞消化下來后做連續的10倍稀釋（10^-2—10^-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96孔板中培養，7-10天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA或Western blot檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。                                                   

重組蛋白質的表達、純化、復性和定量

按Qiagen公司的操作手冊進行，具體步驟如下。

一、重組蛋白質的誘導表達

1. 挑取轉化有質粒的單菌落，接種于3ml 選擇性LB液體培養基中，37 ^oC，250 rpm/min振搖培養過夜。
2. 次日將培養過夜的菌液500 μl再接種于10 ml（1:20）選擇性LB液體培養基中，37 ^oC，250 rpm/min振搖培養至光密度（OD₆₀₀=0.6）時，取1 ml樣本作為誘導前標本，10000g離心1 min收集菌體沉淀，－20 ^oC凍存備用。
3. 加入1 mol/L IPTG于菌液中，使IPTG終濃度為1 mM，37^oC，250 rpm/min振搖培養4～5小時。取1 ml樣本作為誘導后標本，同上法收集菌體沉淀，－20 ^oC凍存備用。
4. 將誘導前后菌體沉淀用20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱5 min，SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍染色3小時后，脫色觀察結果。
5. 選取誘導成功的細菌克隆，擴大誘導規模，收集菌體沉淀，于－20^oC保存，準備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質的分離純化

重組蛋白質的可溶性鑒定

1. 將按上法誘導培養后收集的菌體重懸于裂解液1 (Lysis buffer under native conditions )中，然后在－80^oC低溫冰箱中放置10 min。
2. 冰中解凍。
3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌6次，每次10 sec，間歇10 sec，電壓200-300 V。
4. 10000g，4^oC，離心20 min，取上清（為溶液A），－20^oC保存；另將沉淀用同樣裂解液1溶解（為溶液B），同樣－20^oC保存，供后繼分析使用。
5. 將上述A、B溶液和誘導前后的細菌進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，比較分析重組蛋白質的溶解性。如果誘導表達的蛋白質位于A溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在B溶液中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化

1. 將菌體沉淀溶于適量裂解液2（Lysis buffer under denaturing conditions）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。
2. 10000g，4 ^oC，離心30 min，收集上清液。
3. 將Ni-NTA Agarose充填柱子，并連接于Pharmarcia低壓液相層析系統，用5倍柱體積的裂解液2平衡Ni-NTA Agarose，調節A₂₈₀值至零線。
4. 將適量上清液上樣到Ni-NTA Agarose柱子中，并用lysis buffer沖洗至A₂₈₀值低于0.01。
5. 分別用5～10倍柱體積的清洗液1 和清洗液2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至A₂₈₀值低于0.01。
6. 用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質，在A₂₈₀值監測下，收集出現峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質的復性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用0.01×PBS透析，透析后的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準，采用BIO-RAD公司蛋白質定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質的含量。